Aspetti generali e interazioni tra attività in situ ed ex situ La conservazione ex situ, realizzabile anche grazie alle banche del germoplasma, è una metodologia di mantenimento delle specie che risale ad alcune decine di anni fa e comprende a livello mondiale, circa 250 banche organizzate in molti casi in network nazionali; nella nostra penisola sono operativi circa dieci istituti, per lo più afferenti alle Università, agli Orti Botanici e al CNR.

Il nord Italia, in questo senso, risulta rappresentato dalla Trentino Seed Bank del Museo di Scienze Naturali di Trento, per l’area alpina orientale, e dal Dipartimento di Ecologia del Territorio dell’Università di Pavia, per l’area alpina centrale.

L’arco alpino occidentale non presenta ancora istituzioni di questo genere e vede conservate in banca solo alcune specie comuni al versante francese e custodite nelle strutture del Conservatoire Botanique National Alpin di Gap (CBNA).

La ricchezza eccezionale del nostro territorio, a cavallo tra Alpi e Mediterraneo, necessita dunque di essere valorizzata e tutelata anche attraverso la conservazione ex situ.

La conservazione ex situ consiste nella raccolta del germoplasma (rappresentato da semi, bulbilli, spore, pollini, meristemi ecc.) direttamente nella stazione di origine della specie o, in taluni casi, nella banca colturale del vivaio e nella sua custodia in appositi locali condizionati nella temperatura e nell’umidità relativa. Le fasi successive alla raccolta e che precedono lo stoccaggio definitivo (che avviene all’interno di celle frigorifere) sono numerose e piuttosto delicate e sono finalizzate a garantire la vitalità del germoplasma per periodi di tempo medio lunghi (fino a decine di anni).

La conservazione nelle celle frigo non va comunque interpretata come operazione finale. Questo passaggio rappresenta infatti solo una delle tappe del ciclo di conservazione e come tale viene periodicamente sottoposto a un vaglio per testare la vitalità e il potere germinativo dei semi e per procedere alle eventuali operazioni di rigenerazione.

Ecco quindi evidenziato il punto di giunzione tra il lavoro in situ e quello ex situ, concretizzato in un continuum tra queste due tipologie di approccio che si sostengono vicendevolmente: la ricerca condotta nelle strutture artificiali della banca e del vivaio fornisce gli elementi conoscitivi per le attività di recupero ambientale, per l’individuazione della variabilità genetica esistente, per la pianificazione dei monitoraggi e per l’analisi delle possibili cause di regresso dei taxa. D’altra parte le azioni condotte direttamente sul campo apportano le informazioni utili derivanti dai rilievi floristici e vegetazionali, dai monitoraggi sulle aree di studio, dalle nuove segnalazioni, dalla tassonomia e dalla corologia, tutte attività, queste, svolte dal nostro Centro di Floristica, dall’IPLA e dalla nascente Rete Piemontese dei collaboratori botanici.

La struttura

 La banca del germoplasma è una struttura dotata di strumentazione tecnica e scientifica in grado di accogliere materiale vegetale di diversa natura, analizzarlo, selezionarlo, testarne la vitalità, sottoporlo a processi di condizionamento igro-termico e, infine, stoccarlo in celle frigo a bassa temperatura (una a +4°C, per la collezione attiva e una a -18°C, per la collezione di base).

 

La banca si avvale inoltre di supporti e consulenze esterne per analisi di laboratorio di particolare complessità e per ricerche specifiche nel campo della micropropagazione e della riproduzione in vitro.

Il CBV si è dotato degli spazi e delle apparecchiature necessarie ad espletare tutti i passaggi utili a questi processi avvalendosi, nello specifico, di un locale per la selezione e la pulizia delle accessioni, di un laboratorio di germinazione, di una camera di essiccazione e di due celle frigo.

Il trattamento del germoplasma in entrata nella banca (detto “accessione”), compresa la sua raccolta in situ, fino alla sua eventuale rigenerazione nella camera colturale, viene documentato su schede di lavoro appositamente concepite.

Le procedure: La raccolta e la selezione del germoplasma

Questa fase è organizzata in funzione delle informazioni apprese dalla bibliografia e dal Data Base del Piemonte, e consente di individuare tutte le variabili presenti a livello di stazione, di habitat e di specie. Il prelievo del materiale vegetale (che normalmente è rappresentato da semi) è effettuato seguendo un rigido protocollo che limita la possibilità di errore e la perdita di plasma germinale. I botanici incaricati della raccolta devono prelevare nel luogo e nel momento ideali senza compromettere la maturazione e la vitalità dei semi, rispettando la popolazione esistente e campionando in modo da ottenere una buona rappresentatività della variabilità genetica presente.

Il materiale così raccolto viene tempestivamente consegnato alla banca dove prendono avvio le diverse fasi di trattamento. I lotti vengono analizzati e selezionati per eliminare i semi vani o quelli infestati da patogeni. Questo tipo di lavoro richiede molta pazienza e accuratezza delle operazioni per evitare di conservare campioni di germoplasma non vitali o con contaminazioni latenti.

Durante questi passaggi i semi, se nelle condizioni ideali di maturità morfo-fisiologica, possono essere separati dai frutti ed essere sottoposti a dei test. Uno di questi è il test di valutazione del contenuto idrico interno (moisture content), importante per comprendere se si tratta di semi ortodossi (con % di umidità all’equilibrio comprese tra 12-15%), di semi recalcitranti (con % di umidità > 70%) o di semi intermedi (40-50%).

 Il contenuto di umidità è fondamentale per stabilire la tipologia di conservazione da mettere in atto, individuare la tolleranza alla disidratazione, i tempi e i modi per realizzarla e la longevità stimata dei campioni collezionati.

 

Se il campione di germoplasma a disposizione è insufficiente si procede alla rigenerazione delle piante cercando di stimarne pure la germinabilità e procedendo alla rigenerazione in vivaio. I semi germinati in laboratorio vengono così trasferiti al vivaio dove sono seguiti nelle fasi di crescita fino alla fioritura delle piante e alla loro disseminazione. La nuova generazione di semi permetterà di iniziare tutti i test utili anche per una corretta redazione dei protocolli di riproduzione. Il laboratorio della banca del germoplasma è la struttura indispensabile per preparare i substrati destinati ai test di germinazione, analizzare la vitalità dei lotti, valutare il contenuto di umidità, e per tutte le operazioni di trattamento e condizionamento del germoplasma.

Le apparecchiature e le competenze specifiche dell’Università di Torino completano l’apporto delle conoscenze, indagando a livello genetico sulla variabilità delle popolazioni e sui possibili metodi alternativi di rigenerazione (ad esempio: micropropagazione e riproduzione in vitro).

Le procedure: L’essicazione

La fase più delicata nella gestione delle accessioni è la disidratazione dei semi. Si tratta di un processo piuttosto lungo (può durare anche molti mesi) che per essere eseguita correttamente comporta una conoscenza approfondita della morfologia dei tegumenti e di tutti i parametri fisiologici coinvolti nello sviluppo e nella maturità del seme. Gli stadi di sviluppo dalla fecondazione dell’ovulo all’emergenza della radichetta sono infatti fortemente condizionati da fattori di natura meccanica, chimica, morfologica e fisiologica. Tali fattori possono agire a favore della germinazione ma anche, in condizioni non favorevoli, innescare dormienze più o meno difficili da gestire.

Le barriere alla germinazione possono perciò essere interpretate come delle forme di difesa e di sopravvivenza attivate dalle piante per superare i momenti critici e le condizioni ambientali più sfavorevoli: costituiscono le strategie per la conservazione della specie e per la trasmissione del DNA alla discendenza.

 L’essicazione avviene in una camera appositamente concepita all’interno della quale i valori di temperatura e di umidità relativa sono mantenuti costanti (15-20°C e 15-20% UR). Ogni categoria di semi (ortodossi, recalcitranti, intermedi) tollera un processo di disidratazione differente, che se oltrepassato nei tempi e nei modi può comprometterne la vitalità. Un altro importante fattore da monitorare è lo stato di maturazione del seme: la sua esatta individuazione ci avverte sullo sviluppo completo del seme e sulla sua tolleranza alla perdita di acqua. Una volta che il seme è divenuto igroscopico (cioè pronto per la disidratazione) è necessario ridurre al minimo le variazioni di umidità dell’ambiente in cui si trova, rispettando i suoi tempi di disidratazione e monitorando periodicamente la sua variazione di peso fino al valore predefinito.

La disidratazione dei semi rappresenta ancora oggetto di dibattito e di sperimentazione nell’ambito degli Enti di ricerca e, per questo, le metodologie seguite possono essere anche piuttosto diverse tra loro. In alcuni casi è stata messa a punto anche una forma di liofilizzazione più o meno spinta che ha fornito risultati più che soddisfacenti e che presto adotteremo ai fini sperimentali in collaborazione con il Conservatoire Botanique National Méditerranéen di Porquerolles (CBNMP).

 

Le procedure: Il confezionamento

Raggiunta la percentuale di umidità interna ideale per garantire la vitalità dei semi si procede al loro confezionamento. Anche questo è un passaggio che richiede accuratezza e precisione e che può essere eseguito con modalità diverse. In taluni casi si fa uso di buste di alluminio multistrato, in altri di arbarelle di vetro con guarnizione in gomma naturale, in altri di provette di vetro chiuse alla fiamma con ossigeno-propano. La nostra banca ha deciso di seguire il modello del CBNMP avvalendosi di vials e boccette in vetro pirex ad uso farmaceutico, con chiusura ermetica. I lotti più piccoli contenuti nelle fialette vengono inoltre introdotti in contenitori in plastica pratici per la classificazione e antiurto. All’interno delle fialette vengono riposti i semi, un setto di cotone idrofobo e uno strato di alcuni centimetri di silica gel. Questo ultimo è uno strumento fondamentale per il controllo periodico delle accessioni e la valutazione del loro stato di disidratazione. Infatti, il viraggio dal giallo all’azzurro di tale sostanza indica senza ombra di dubbio una presenza di umidità proveniente dai semi (magari non ben disidratati) o dall’esterno (e allora può trattarsi di un problema di sigillo non ermetico).

 

Le procedure: Lo stoccaggio

La collocazione delle accessioni nelle celle frigo rispecchia il quantitativo di semi a disposizione e la possibilità di creare una collezione di base da congelare a -18°C e da monitorare periodicamente (ogni 3-5 anni), destinata a periodi medio lunghi di conservazione, e di una collezione attiva conservata a +4°C, utilizzabile per tutti i fini di ricerca e di studio del germoplasma e riservata a restare nelle celle per periodi più brevi. Lo spazio a disposizione nelle celle è piuttosto limitato e dunque deve essere sfruttato nella maniera più razionale possibile.

Il recupero dei lotti e delle accessioni deve essere concepito secondo un ordine preciso dando la priorità all’anno di conservazione e ad opportuni codici di riconoscimento. In questa fase come in tutti gli altri passaggi l’ordine rappresenta un imperativo assoluto e fondamentale per evitare di incorrere in confusioni, perdita di materiale, di dati e di tempo.

Le procedure: I test di vitalità

Per preservare inalterato il potere germinativo del plasma è necessario che i semi conservati sviluppino, germinando, piante complete in grado di riprodursi, anche dopo svariato tempo.

Questa importante valutazione viene fatta attraverso l’avvio di test che misurano la percentuale e la velocità di germinazione. Essi sono condotti, nel caso si tratti di specie già studiate, seguendo appositi protocolli che indicano passo passo le modalità cui sottoporre i lotti in termini di trattamenti, di condizionamento idrico, termico e di fotoperiodo, nonché le eventuali procedure preventive per il superamento delle dormienze.

Aspetti generali e interazioni tra attività in situ ed ex situ La conservazione ex situ, realizzabile anche grazie alle banche del germoplasma, è una metodologia di mantenimento delle specie che risale ad alcune decine di anni fa e comprende a livello mondiale, circa 250 banche organizzate in molti casi in network nazionali; nella nostra penisola sono operativi circa dieci istituti, per lo più afferenti alle Università, agli Orti Botanici e al CNR.

Il nord Italia, in questo senso, risulta rappresentato dalla Trentino Seed Bank del Museo di Scienze Naturali di Trento, per l’area alpina orientale, e dal Dipartimento di Ecologia del Territorio dell’Università di Pavia, per l’area alpina centrale.

L’arco alpino occidentale non presenta ancora istituzioni di questo genere e vede conservate in banca solo alcune specie comuni al versante francese e custodite nelle strutture del Conservatoire Botanique National Alpin di Gap (CBNA).

La ricchezza eccezionale del nostro territorio, a cavallo tra Alpi e Mediterraneo, necessita dunque di essere valorizzata e tutelata anche attraverso la conservazione ex situ.

La conservazione ex situ consiste nella raccolta del germoplasma (rappresentato da semi, bulbilli, spore, pollini, meristemi ecc.) direttamente nella stazione di origine della specie o, in taluni casi, nella banca colturale del vivaio e nella sua custodia in appositi locali condizionati nella temperatura e nell’umidità relativa. Le fasi successive alla raccolta e che precedono lo stoccaggio definitivo (che avviene all’interno di celle frigorifere) sono numerose e piuttosto delicate e sono finalizzate a garantire la vitalità del germoplasma per periodi di tempo medio lunghi (fino a decine di anni).

La conservazione nelle celle frigo non va comunque interpretata come operazione finale. Questo passaggio rappresenta infatti solo una delle tappe del ciclo di conservazione e come tale viene periodicamente sottoposto a un vaglio per testare la vitalità e il potere germinativo dei semi e per procedere alle eventuali operazioni di rigenerazione.

Ecco quindi evidenziato il punto di giunzione tra il lavoro in situ e quello ex situ, concretizzato in un continuum tra queste due tipologie di approccio che si sostengono vicendevolmente: la ricerca condotta nelle strutture artificiali della banca e del vivaio fornisce gli elementi conoscitivi per le attività di recupero ambientale, per l’individuazione della variabilità genetica esistente, per la pianificazione dei monitoraggi e per l’analisi delle possibili cause di regresso dei taxa. D’altra parte le azioni condotte direttamente sul campo apportano le informazioni utili derivanti dai rilievi floristici e vegetazionali, dai monitoraggi sulle aree di studio, dalle nuove segnalazioni, dalla tassonomia e dalla corologia, tutte attività, queste, svolte dal nostro Centro di Floristica, dall’IPLA e dalla nascente Rete Piemontese dei collaboratori botanici.

La struttura

La banca del germoplasma è una struttura dotata di strumentazione tecnica e scientifica in grado di accogliere materiale vegetale di diversa natura, analizzarlo, selezionarlo, testarne la vitalità, sottoporlo a processi di condizionamento igro-termico e, infine, stoccarlo in celle frigo a bassa temperatura (una a +4°C, per la collezione attiva e una a -18°C, per la collezione di base).

La banca si avvale inoltre di supporti e consulenze esterne per analisi di laboratorio di particolare complessità e per ricerche specifiche nel campo della micropropagazione e della riproduzione in vitro.

Il CBV si è dotato degli spazi e delle apparecchiature necessarie ad espletare tutti i passaggi utili a questi processi avvalendosi, nello specifico, di un locale per la selezione e la pulizia delle accessioni, di un laboratorio di germinazione, di una camera di essiccazione e di due celle frigo.

Il trattamento del germoplasma in entrata nella banca (detto “accessione”), compresa la sua raccolta in situ, fino alla sua eventuale rigenerazione nella camera colturale, viene documentato su schede di lavoro appositamente concepite.

Le procedure: La raccolta e la selezione del germoplasma

Questa fase è organizzata in funzione delle informazioni apprese dalla bibliografia e dal Data Base del Piemonte, e consente di individuare tutte le variabili presenti a livello di stazione, di habitat e di specie. Il prelievo del materiale vegetale (che normalmente è rappresentato da semi) è effettuato seguendo un rigido protocollo che limita la possibilità di errore e la perdita di plasma germinale. I botanici incaricati della raccolta devono prelevare nel luogo e nel momento ideali senza compromettere la maturazione e la vitalità dei semi, rispettando la popolazione esistente e campionando in modo da ottenere una buona rappresentatività della variabilità genetica presente.

Il materiale così raccolto viene tempestivamente consegnato alla banca dove prendono avvio le diverse fasi di trattamento. I lotti vengono analizzati e selezionati per eliminare i semi vani o quelli infestati da patogeni. Questo tipo di lavoro richiede molta pazienza e accuratezza delle operazioni per evitare di conservare campioni di germoplasma non vitali o con contaminazioni latenti.

Durante questi passaggi i semi, se nelle condizioni ideali di maturità morfo-fisiologica, possono essere separati dai frutti ed essere sottoposti a dei test. Uno di questi è il test di valutazione del contenuto idrico interno (moisture content), importante per comprendere se si tratta di semi ortodossi (con % di umidità all’equilibrio comprese tra 12-15%), di semi recalcitranti (con % di umidità > 70%) o di semi intermedi (40-50%).

Il contenuto di umidità è fondamentale per stabilire la tipologia di conservazione da mettere in atto, individuare la tolleranza alla disidratazione, i tempi e i modi per realizzarla e la longevità stimata dei campioni collezionati.

Se il campione di germoplasma a disposizione è insufficiente si procede alla rigenerazione delle piante cercando di stimarne pure la germinabilità e procedendo alla rigenerazione in vivaio. I semi germinati in laboratorio vengono così trasferiti al vivaio dove sono seguiti nelle fasi di crescita fino alla fioritura delle piante e alla loro disseminazione. La nuova generazione di semi permetterà di iniziare tutti i test utili anche per una corretta redazione dei protocolli di riproduzione. Il laboratorio della banca del germoplasma è la struttura indispensabile per preparare i substrati destinati ai test di germinazione, analizzare la vitalità dei lotti, valutare il contenuto di umidità, e per tutte le operazioni di trattamento e condizionamento del germoplasma.

Le apparecchiature e le competenze specifiche dell’Università di Torino completano l’apporto delle conoscenze, indagando a livello genetico sulla variabilità delle popolazioni e sui possibili metodi alternativi di rigenerazione (ad esempio: micropropagazione e riproduzione in vitro).

Le procedure: L’essicazione

La fase più delicata nella gestione delle accessioni è la disidratazione dei semi. Si tratta di un processo piuttosto lungo (può durare anche molti mesi) che per essere eseguita correttamente comporta una conoscenza approfondita della morfologia dei tegumenti e di tutti i parametri fisiologici coinvolti nello sviluppo e nella maturità del seme. Gli stadi di sviluppo dalla fecondazione dell’ovulo all’emergenza della radichetta sono infatti fortemente condizionati da fattori di natura meccanica, chimica, morfologica e fisiologica. Tali fattori possono agire a favore della germinazione ma anche, in condizioni non favorevoli, innescare dormienze più o meno difficili da gestire.

Le barriere alla germinazione possono perciò essere interpretate come delle forme di difesa e di sopravvivenza attivate dalle piante per superare i momenti critici e le condizioni ambientali più sfavorevoli: costituiscono le strategie per la conservazione della specie e per la trasmissione del DNA alla discendenza.

L’essicazione avviene in una camera appositamente concepita all’interno della quale i valori di temperatura e di umidità relativa sono mantenuti costanti (15-20°C e 15-20% UR). Ogni categoria di semi (ortodossi, recalcitranti, intermedi) tollera un processo di disidratazione differente, che se oltrepassato nei tempi e nei modi può comprometterne la vitalità.

Un altro importante fattore da monitorare è lo stato di maturazione del seme: la sua esatta individuazione ci avverte sullo sviluppo completo del seme e sulla sua tolleranza alla perdita di acqua. Una volta che il seme è divenuto igroscopico (cioè pronto per la disidratazione) è necessario ridurre al minimo le variazioni di umidità dell’ambiente in cui si trova, rispettando i suoi tempi di disidratazione e monitorando periodicamente la sua variazione di peso fino al valore predefinito.

La disidratazione dei semi rappresenta ancora oggetto di dibattito e di sperimentazione nell’ambito degli Enti di ricerca e, per questo, le metodologie seguite possono essere anche piuttosto diverse tra loro. In alcuni casi è stata messa a punto anche una forma di liofilizzazione più o meno spinta che ha fornito risultati più che soddisfacenti e che presto adotteremo ai fini sperimentali in collaborazione con il Conservatoire Botanique National Méditerranéen di Porquerolles (CBNMP).

Le procedure: Il confezionamento

Raggiunta la percentuale di umidità interna ideale per garantire la vitalità dei semi si procede al loro confezionamento. Anche questo è un passaggio che richiede accuratezza e precisione e che può essere eseguito con modalità diverse. In taluni casi si fa uso di buste di alluminio multistrato, in altri di arbarelle di vetro con guarnizione in gomma naturale, in altri di provette di vetro chiuse alla fiamma con ossigeno-propano. La nostra banca ha deciso di seguire il modello del CBNMP avvalendosi di vials e boccette in vetro pirex ad uso farmaceutico, con chiusura ermetica. I lotti più piccoli contenuti nelle fialette vengono inoltre introdotti in contenitori in plastica pratici per la classificazione e antiurto. All’interno delle fialette vengono riposti i semi, un setto di cotone idrofobo e uno strato di alcuni centimetri di silica gel. Questo ultimo è uno strumento fondamentale per il controllo periodico delle accessioni e la valutazione del loro stato di disidratazione. Infatti, il viraggio dal giallo all’azzurro di tale sostanza indica senza ombra di dubbio una presenza di umidità proveniente dai semi (magari non ben disidratati) o dall’esterno (e allora può trattarsi di un problema di sigillo non ermetico).

Le procedure: Lo stoccaggio

La collocazione delle accessioni nelle celle frigo rispecchia il quantitativo di semi a disposizione e la possibilità di creare una collezione di base da congelare a -18°C e da monitorare periodicamente (ogni 3-5 anni), destinata a periodi medio lunghi di conservazione, e di una collezione attiva conservata a +4°C, utilizzabile per tutti i fini di ricerca e di studio del germoplasma e riservata a restare nelle celle per periodi più brevi. Lo spazio a disposizione nelle celle è piuttosto limitato e dunque deve essere sfruttato nella maniera più razionale possibile.

Il recupero dei lotti e delle accessioni deve essere concepito secondo un ordine preciso dando la priorità all’anno di conservazione e ad opportuni codici di riconoscimento.

In questa fase come in tutti gli altri passaggi l’ordine rappresenta un imperativo assoluto e fondamentale per evitare di incorrere in confusioni, perdita di materiale, di dati e di tempo.

Le procedure: I test di vitalità

Per preservare inalterato il potere germinativo del plasma è necessario che i semi conservati sviluppino, germinando, piante complete in grado di riprodursi, anche dopo svariato tempo.

Questa importante valutazione viene fatta attraverso l’avvio di test che misurano la percentuale e la velocità di germinazione. Essi sono condotti, nel caso si tratti di specie già studiate, seguendo appositi protocolli che indicano passo passo le modalità cui sottoporre i lotti in termini di trattamenti, di condizionamento idrico, termico e di fotoperiodo, nonché le eventuali procedure preventive per il superamento delle dormienze.

L’analisi dei risultati attraverso curve e funzioni conduce all’interpretazione degli aspetti meno conosciuti e alla pianificazione delle nuove azioni da mettere in atto nella ricerca. L’adozione di altri test di supporto, come ad esempio quello del TTC (trifeniltetrazolo cloruro), contribuisce ad individuare lo stato di vitalità dei tessuti e dell’embrione.

Le procedure: La rigenerazione Questa procedura si applica nei seguenti casi:

• quando la disponibilità di semi stoccati nelle celle è troppo bassa; * quando è necessario effettuare dei test di germinazione e non si dispone di campioni sufficientemente grandi e rappresentativi per delle valutazioni statistiche; * quando è necessario determinare la specie per fugare i dubbi emersi durante la raccolta del germoplasma; * quando si vuole destinare la specie ad attività di ripristino ambientale o al recupero di habitat minacciati.

Il tipo di scelte pianificate comporta il difficile passaggio dagli ambienti sterili e controllati del laboratorio, dove i semi germinati sono ripicchettati su un substrato sterile e in condizioni ambientali artificiali, alle strutture del vivaio. Tale transizione è estremamente delicata e se condotta senza le dovute precauzioni può seriamente compromettere la levata e il successivo sviluppo delle piantine.

Il trasferimento dalla camera di coltura ai tunnel ed alle serre del vivaio necessita quindi di un’efficientissima organizzazione del lavoro e degli spazi a disposizione ed un’intesa ottimale tra il curatore della banca e quello del vivaio e tra quest’ultimo e la sua squadra di operatori.